瓊脂糖偶聯(lián)甘露糖的凝膠制備主要涉及瓊脂糖與甘露糖的混合及凝膠化過程，以下是詳細(xì)的制備步驟及注意事項：

一、材料準(zhǔn)備

• 瓊脂糖：選擇合適的瓊脂糖濃度，根據(jù)目標(biāo)分子大小調(diào)整。例如，分離1kb以下DNA推薦使用1.5%濃度，大片段（>5kb）則用0.5%濃度。

• 甘露糖：作為配體，與瓊脂糖混合以改善凝膠性能。

• 緩沖液：常用TAE（Tris-Acetate-EDTA）或TBE（Tris-Borate-EDTA），需與制膠緩沖液一致。

• 其他材料：制膠模具（含梳子）、電泳槽、染料（如溴化乙錠EB或更安全的RedView/GelGreen）等。

二、制備過程

1. 緩沖液配制：

• 根據(jù)需要配制適當(dāng)濃度的緩沖液，如將5×TBE緩沖液稀釋至0.5×TBE。

2. 膠液制備：

• 稱取適量瓊脂糖，置于錐形瓶中。

• 加入配制好的緩沖液，放入微波爐或電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。

3. 膠板制備：

• 將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住，置于水平支持物上。

• 插上樣品梳子，注意梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。

• 向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入染料（如EB），使其終濃度為0.5μg/ml（也可電泳后再染色）。

• 用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。

4. 凝膠凝固：

• 待膠凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠。

• 向槽內(nèi)加入緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。

5. 甘露糖偶聯(lián)（此步驟可能因具體實驗需求而異，以下是一種可能的偶聯(lián)方式）：

• 在凝膠制備過程中或制備后，通過化學(xué)方法將甘露糖偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上。這通常涉及使用偶聯(lián)劑（如碳二亞胺）將甘露糖的羧基與瓊脂糖的氨基或羥基連接起來。

• 偶聯(lián)條件（如溫度、pH值、反應(yīng)時間）需根據(jù)具體實驗需求進(jìn)行優(yōu)化。

三、注意事項

• 溫度控制：瓊脂糖溶液溫度過高（>65℃）會導(dǎo)致孔徑不均，過低則凝固緩慢。倒膠前建議膠液冷卻至50-60℃。

• 氣泡排除：倒膠前用移液槍吸出氣泡，或加入少量異丙醇輔助消泡。灌膠后盡量排除梳孔之間或底部的氣泡。

• 凝膠厚度：凝膠厚度建議3-5mm，以獲得良好的分離效果。

• 染料選擇：EB具有致癌性，操作時需戴手套、護(hù)目鏡，染色后避免長時間暴露?？蛇x擇無毒害性的核酸染料（如RedView）。

• 儲存條件：未用完的凝膠可浸泡于電泳緩沖液中，4℃保存不超過2周。

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